Morrison est né à Fort Ord, Californie. Après avoir participé très jeune à un atelier théâtre dans un centre de vacances, il décide de devenir acteur. Il étudie à l'Université de New York Tisch School of the Arts, à l'école supérieure des Arts du comté d'Orange ainsi qu'à Los Alamitos High School.

Il commence sa carrière dans une comédie musicale de Broadway ; une version musicale de Footloose, suivie par un rôle dans The Rocky Horror Show. Sa carrière prendra tout son sens à partir de sa participation dans la production de John Waters qui lui confie le rôle de Link Larkin dans la comédie musicale Hairspray. À partir de là, il commencera à travailler pour la télévision et fera des apparitions dans des séries telles que Ghost Whisperer, Le Justicier de l'ombre ou Sex and the City. Il enchaîne aussi ses premiers petits rôles au cinéma dans des films comme Marci X, Primary Colors, et Simply Funk. Il interprète également le rôle de Sir Harry dans la production ABC-TV Once Upon a Mattress, aux côtés de Tracey Ullman et Carol Burnett.
En 2001, Matthew fait partie du groupe pop LMNT. On les entends notamment dans la Bande son Original de Kim Possible avec "It's just you" , dans Lizzie Mcguire le film "Open your eyes", et aussi dans la série éponyme : épisode 11 de la saison 3 "Lizzie in the middle" on retrouve alors un extrait de leur chanson "Hey Juliet". En 2005, Morrison reprend un rôle dans une comédie musicale. Il joue le rôle de Fabrizio Nacarelli dans The Light in the Piazza et sera nommé aux Tony Award pour sa performance. Il quitte le spectacle le 1er septembre 2005.
Morrison rejoint le casting du soap opera As the World Turns dans le rôle d'Adam Munson le 24 octobre 2006 mais quittera rapidement le programme.
Il remportera une nomination au Drama Desk pour son rôle dans le spectacle 10 Million Miles qu'il joua avec l'Atlantic Theater Company en 2007. La même année, il apparaitra dans deux films ; Coup de foudre à Rhode Island et Le Come-Back.
Actuellement, Morrison joue le rôle de Will Schuester dans la série télévisée Glee diffusée sur la FOX depuis le 19 mai 2009.
Le 14 janvier 2010, Mercury Records annonce avoir signé un contrat avec Matthew Morrison. Son premier album solo est sorti en début du mois de Mai 2011