Hayden a commencé à apparaître dans des films publicitaires à onze mois, d'abord dans une publicité pour Playskool. Elle a décroché le rôle de Sarah Roberts dans le soap opera ABC One Life to Live (1994-1997). Alors que dans Guiding Light, son personnage Lizzie a combattu la leucémie. Pour attirer l'attention des téléspectateurs à la maladie, et pour améliorer la prise de conscience nationale, la Leukemia and Lymphoma Society lui a donné un prix de reconnaissance spéciale.
Elle devient plus populaire en jouant le rôle de Claire Bennet dans la série Heroes de NBC, créée par Tim Kring. Une jeune lycéenne pom-pom girl avec un pouvoir de régénération cellulaire spontanée. Grâce à son rôle dans Heroes, elle devient une invitée régulière sur le circuit des conventions de science-fiction, invitée à assister à des conventions à travers le monde en 2007, y compris la Gen Con à New York, Comic-Con et Fan Expo Canada. Panettiere s'est plaint que ses options sont parfois limitées, car les gens qui la regardent la voient comme pom-pom girl populaire ou simplement « la blonde ».

Elle est apparue dans plus d'une douzaine de longs métrages, plusieurs films réalisés pour la télévision et elle a fait la voix de Dot dans 1001 pattes. Elle a joué le rôle de la fille de l'entraîneur Yoast, Sheryl, dans le film Le Plus Beau des combats. En outre, elle a fait la voix de Kairi dans la série de jeux vidéo Kingdom Hearts pour la console PlayStation 2. Panettiere est apparu sur la chaîne Fox dans la série Ally McBeal en tant que la fille de celle-ci, et avait un rôle d'invitée récurrente dans Malcolm in the Middle et des apparitions dans Law & Order: Special Victims Unit. Elle a joué dans Bring It On: All or Nothing comme une meneuse de claque et avait un rôle de soutien en tant que Adelaide Bourbon dans le récent film indépendant de Shanghai Kiss. Elle est apparue dans le film de Disney Channel Tiger Cruise, dans le film Fashion maman dans le rôle de sa nièce adolescente, et dans Ice Princess, comme une étudiante populaire et patineuse rivale.
Au début de 2007, Panettiere est apparue dans le show MTV Ashton Kutcher-produit, Punk'd. L'apparition a été conçu par sa mère et un "fan" impliqué afin de discuter de ses travaux avec elle. Elle est apparue dans le film Fireflies in the Garden dans le rôle de la version plus jeune du personnage d'Emily Watson, Jane Lawrence. En décembre 2007 Panettiere a été nommé Obsession de l'année par le GQ Magazine de l'année. Forbes estime que elle a obtenu 2 millions de dollars en 2007.
En septembre 2008, Panettiere apparu dans une vidéo satirique, une maquette PSA (message d'intérêt public) sur funnyordie.com, intitulé « Hayden Panettiere PSA : votre voix, votre choix. ». Encore une fois, en octobre, Panettiere apparue dans une autre satirique vidéo PSA sur funnyordie.com intitulé « votez pour McCain : Il est comme George Bush, à l'exception âgé et avec une plus mauvaise humeur ».
En juillet 2009, Panettiere a joué dans la comédie pour adolescents I Love You, Beth Cooper, dans laquelle elle jouait Beth Cooper, la chef pom-pom girl du lycée.
En 2010, elle joue aussi dans la vidéo britannique de la chanson de Joshua Radin, I'd Rather Be With You. En mai 2010, Panettiere a signé dans la suite à venir de la franchise Scream, Scream 4. Elle jouera le rôle de Kirby Reed aux côtés de Emma Roberts et Rory Culkin.