Elle commença à s'intéresser à la comédie en jouant dans une production locale du Magicien d'Oz. À 11 ans, elle déménage avec sa famille à New York et commence une courte carrière de mannequin pour l'agence Wilhelmina puis réalisera ensuite plusieurs campagnes publicitaires notamment pour Ralph Lauren. Elle travaillera également avec Sofia Coppola.

En 1999, Leighton fait des débuts à la télévision à 13 ans dans la série New York Police Judiciaire, suivi d'autres apparitions à la télévision dans la série Boston Public et tourne le temps d'un épisode dans la série Cher oncle Bill.
En 2003, elle fait ses premiers pas au cinéma dans La Malédiction du Pendu. À la télévision, elle fait une apparition dans la série Jane et Tarzan. L'année suivante, elle tourne dans le téléfilm Hollywood Division et continue à la même période d'enchainer les apparitions dans les séries Preuve à l'appui, Sept à la maison, North Shore : Hôtel du Pacifique et Entourage, 24 heures chrono, Touche pas à mes filles, Veronica Mars et Surface.
En 2006, elle tourne dans deux films Flourish et Inside. Elle apparait aussi dans les séries Secrets of a Small Town, Dr House (où elle participe à trois épisodes dans le rôle d'une jeune femme ayant le béguin pour House) et NUMB3RS. En 2007, elle enchaine les films comme Burger Kill, The Beautiful Ordinary et Killer Movie. Elle tournera dans un téléfilm, The Haunting of Sorority Row et fera deux apparitions dans Les Experts : Miami et Shark.
Enfin, elle décrochera le rôle qui la fera connaitre du grand public, celui de Blair Waldorf dans la série de la CW Gossip Girl. En 2008 et 2009, elle se concentrera principalement sur la série et sur son album. En 2010, elle apparaîtra dans deux comédies : Crazy Night où elle joue la baby sitter et Trop loin pour toi. En 2011, Leighton sera dans 3 films : Country Strong, The Roommate (avec Danneel Harris, Cam Gigandet, Alyson Michalka et Minka Kelly) et Monte Carlo (avec Selena Gomez, Katie Cassidy et Cory Monteith).