Née et élevée à Davenport, dans l’Iowa, Mary Beth Peil a commencé ses études à l’opéra de l’université de Northwestern pour se diriger ensuite à New York après avoir été repérée. Elle a commencé à travailler sérieusement avec le Metropolitan Opera National Company et passe aussitôt sous contrat avec celui-ci, exécutant des opéras à travers tout le pays.

Le tournant de sa vie arrive par une proposition de rôle dans une pièce musicale Kiss Me Kate. La production régionale du Minnesota, étant une entreprise importante, lui donne goût à cette nouvelle carrière artistique. Elle décide donc de poursuivre ce chemin qui lui réservera de nombreuses surprises …

Elle est apparue à Broadway avec Yul Brynner dans The King and Me avec comme rôle celui d’Anna, décrochant une nomination : un Tony Award pour la meilleure actrice en 1985. Elle a été également honorée de plusieurs récompenses notamment dans Paul Rudnick's The Naked Truth, A.R. Gurney's A Cheever Evening et Craig Lucas' Missing Persons. Mary Beth Peil a aussi travaillé, avec la star James Van Der Beek de la série Dawson’s Creek, il y a quelques années, sur les planches de Broadway, jouant sa mère dans la pièce Finding the Sun qui a été écrite et dirigée par le metteur en scène Edward Albee.
Sur le grand écran, Mary Beth Peil est apparue avec Jack Lemmon et Walter Matthau dans The Odd Couple II. Elle est également apparue dans Reckless et Jersey Girl.

Mary Beth Peil habite actuellement à New York et est apparue dernièrement dans une nouvelle comédie musicale They All Laughed au Goodspeed Opera House dans le Connecticut.