Yolande Moreau débute dans des spectacles pour enfants au théâtre des enfants de la Ville de Bruxelles (et contrairement aux informations circulant dans la presse, elle n'a jamais travaillé comme éducatrice). Puis elle choisit de se consacrer à la comédie. Elle écrit en 1981 Sale affaire, du sexe et du crime, un one-woman-show dans lequel elle interprète une femme qui vient de tuer son amant. Elle présente ce spectacle au Festival du rire de Rochefort (Belgique) où elle remporte le Grand Prix en 1982.
Agnès Varda lui offre ses premiers rôles au cinéma dans le court-métrage 7 p., cuis., s. de b., ... à saisir en 1984 puis l'année suivante dans Sans toit ni loi.
En 1989, Yolande Moreau rejoint la troupe de Jérôme Deschamps et Macha Makeïeff, dont elle devient l'un des piliers. Des spectacles Lapin chasseur ou Les Pieds dans l'eau au programme télévisé Les Deschiens, elle joue un personnage fruste et loufoque.
En 2004, elle interprète et co-réalise, avec Gilles Porte, Quand la mer monte... où elle joue le rôle, tiré de sa propre expérience, d'une comédienne-humoriste en tournée dans le Nord de la France et en Belgique. Pour ce film, elle se voit décerner le Prix Louis-Delluc du meilleur premier film puis les Césars de la meilleure première œuvre de fiction et de la meilleure actrice.
En 2008, elle rejoue Sale affaire, du sexe et du crime à l'occasion du Festival international de la bande dessinée d'Angoulême, dans une nouvelle mise en scène, illustrée en direct par le dessinateur Pascal Rabaté. Elle est également l'actrice vedette de Séraphine de Martin Provost, biographie filmée du peintre Séraphine de Senlis (de son vrai nom Séraphine Louis). Son interprétation lui vaut, en 2009, le César de la meilleure actrice pour la seconde fois de sa carrière.
Elle tient aussi, avec son compatriote Bouli Lanners, le haut de l'affiche de Louise-Michel, comédie sociale et burlesque de Benoît Delépine et Gustave Kervern. Elle y joue le rôle d'une ouvrière picarde qui propose à ses collègues de consacrer collectivement leurs indemnités de licenciement pour trouver un tueur professionnel chargé de liquider le patron qui vient de fermer leur usine.
En 2010, elle joue dans Mammuth des mêmes réalisateurs et apparaît également dans Gainsbourg, vie héroïque de Joann Sfar .